Il Next Generation Sequencing (NGS) rappresenta un insieme di tecnologie ad alta produttività che consentono il sequenziamento massivo e parallelo di milioni di frammenti di DNA, rivoluzionando la genetica medica rispetto al sequenziamento tradizionale di Sanger sequencing.

L’NGS si basa su tre principi fondamentali:

• Parallelizzazione massiva: sequenziamento simultaneo di milioni di frammenti
• Miniaturizzazione: reazioni su scala microscopica (flow cell o beads)
• Elevata profondità di lettura (coverage): ogni base viene letta più volte

Questo permette:

• maggiore sensibilità diagnostica
• identificazione di varianti rare
• analisi dell’intero genoma o di regioni selezionate

Workflow del sequenziamento NGS

Il processo NGS si articola in diverse fasi:

Le varianti vengono interpretate secondo linee guida (es. ACMG/AMP)

La classificazione delle varianti genetiche secondo le linee guida ACMG/AMP (American College of Medical Genetics and Genomics / Association for Molecular Pathology) è lo standard internazionale più utilizzato per interpretare il significato clinico delle varianti del DNA identificate nei test genetici.

Categorie di classificazione (ACMG 2015)

Le varianti genetiche vengono suddivise in cinque classi principali, basate sul livello di evidenza disponibile riguardo la loro associazione con la malattia:

Criteri aggiuntivi ACMG nella classificazione delle varianti (2021)

ACMG evidenzia l’importanza che il clinico fornisca al laboratorio dettagli fenotipici e dati della storia familiare, ma anche caratteristiche del fenotipo apparentemente non collegate con il sospetto clinico. Nella fase interpretativa è mandatoria un’interazione diretta tra clinici e laboratorio che può aiutare sia nella prioritizzazione delle varianti che nella loro interpretazione.

Tipi di varianti identificabili

L’NGS consente di rilevare:

• SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
• Indel (inserzioni/delezioni)
• CNV (Copy Number Variations)
• Varianti strutturali (più difficili)

Vantaggi dell’NGS

• Elevata sensibilità
• Analisi simultanea di molti geni
• Riduzione dei costi per base
• Applicabile a:
  • malattie genetiche rare
  • oncologia (mutazioni somatiche)
  • farmacogenomica

Limiti dell’NGS

• Errori sistematici
• Difficoltà nelle:
  • varianti strutturali complesse
  • regioni ripetitive
• Necessità di validazione (es. con Sanger sequencing)
• Interpretazione clinica complessa (varianti di significato incerto – VUS)

Applicazioni in Genetica Medica

• Diagnosi di malattie mendeliane
• Screening neonatale avanzato
• Oncogenetica (tumori ereditari e somatici)
• Diagnosi prenatale (NIPT)
• Medicina personalizzata

Confronto con il sequenziamento Sanger